该研究揭示了一种由缺氧特异性诱导的ZHX2相分离机制。研究发现，转录因子ZHX2在缺氧反应下发生相分离，促进其在染色质上的占据，并激活一系列癌基因的转录。这些基因富集为转移相关基因，且不同于HIF的靶点，与乳腺癌的病理进展密切相关。机制上，缺氧通过一个富含脯氨酸的内在无序区诱导ZHX2相分离，这会增强ZHX2在S625和S628位点的磷酸化，进而将CTCF招募到转录凝聚体中，改变染色质环，最终驱动转移基因的转录和癌症转移。这些发现为理解癌基因激活提供了重要见解，并提示了一种基于相分离的癌症治疗策略。

1、ZHX2在缺氧反应下形成核内凝聚体

研究通过荧光成像技术，在多种乳腺癌细胞系（MCF7, T47D, MDA-MB-231）中观察到，ZHX2-EGFP在缺氧（1% O₂）条件下会形成明显的核内凝聚体，而在常氧（21% O₂）条件下则弥散分布。

这种凝聚体的形成是可逆的，在复氧后30秒内斑点即消失。ZHX2的聚集是缺氧特异性的，在其他细胞应激（如pH变化、葡萄糖/谷氨酰胺饥饿、MG132、UV照射等）下均未观察到斑点形成。

而在乳腺癌患者的肿瘤组织和异种移植肿瘤模型中也观察到了ZHX2核凝聚体。

2、富含脯氨酸的IDR介导ZHX2的缺氧诱导相分离

研究使用1,6-己二醇（1,6-hex）处理细胞，可阻断缺氧诱导的ZHX2凝聚体形成。

体外纯化的重组ZHX2-EGFP蛋白在特定浓度下也表现出盐敏感的球形斑点，证实了ZHX2凝聚体具有相分离特性。通过结构预测和OptoDroplet光遗传学技术分析，研究发现ZHX2的核定位序列（NLS；317-446 aa）区域内的IDR是驱动其相分离的主要区域；

删除NLS（ΔNLS）则无法在光照或缺氧下形成斑点（D-G）。

将该区域的7个脯氨酸全部突变为丙氨酸（PA突变体）后，ZHX2在缺氧条件下完全丧失了形成凝聚体的能力。这表明，该富含脯氨酸的IDR是ZHX2响应缺氧并诱导相分离的关键。

3、ZHX2相分离作为支架招募转录激活复合体

免疫荧光染色显示，缺氧诱导的ZHX2凝聚体与多种转录激活标记（H3K27ac, H3K4me1, H3K4me3, MED1, BRD4, RNA Pol II-S5P, p300）高度共定位。

Co-IP实验证实，与常氧相比，ZHX2在缺氧时与RNA Pol II-S5P, p300, BRD4, 和 MED1的相互作用显著增强。

而无法发生相分离的PA突变体，在缺氧时几乎不与这些共激活因子共定位，也几乎不发生相互作用。这些结果表明，ZHX2在缺氧时首先独立发生相分离，并作为“支架”招募这些转录共激活因子到凝聚体中。

4、ZHX2相分离激活一套不同于HIF靶点的转移基因特征集

ChIP-seq分析结果显示，在缺氧条件下，ZHX2在全基因组的占据位点数量和结合强度均显著增加，而PA突变体的基因组占据和结合强度与WT型相比则明显下降，表明ZHX2的相分离是其在缺氧时广泛结合染色质所必需的。

结合RNA-seq的结果综合分析，研究鉴定出125个“ZHX2 相分离基因”，它们在缺氧时以相分离依赖的方式被ZHX2直接结合并转录激活，且其激活独立于HIF1α/HIF2α（C, D, E）。

GO富集分析结果显示，这些基因高度富集在与癌症转移相关的通路。对乳腺癌患者的scRNA-seq数据分析证实，该转移特征集主要在恶性细胞中高表达。

5、ZHX2相分离通过招募CTCF重塑染色质环

Co-IP和FRET-FLIM实验证明，缺氧诱导了ZHX2和CTCF之间的直接相互作用（A, B），而PA突变体则无法与CTCF结合。免疫荧光显示，CTCF本身在缺氧时也会形成核内斑点，并与ZHX2凝聚体高度共定位（C），表明ZHX2的IDR依赖性相分离将CTCF“拉入”了凝聚体中。

Hi-C实验进一步揭示，缺氧导致了全局性的染色质环重编程，产生了大量缺氧特异性的染色质环（D）。这种染色质环的重塑依赖于ZHX2（E）。3C-qPCR实验结果证实，ZHX2的PA突变体无法拯救由ZHX2敲低导致的MYC和STC2 E-P环的丢失（G）。

6、ZHX2相分离促进的S625/S628磷酸化是招募CTCF和驱动转移的关键

蛋白质谱（LC-MS/MS）分析鉴定出ZHX2的两个相分离增强的磷酸化位点：S625和S628。这两个位点仅在缺氧时，且在具有相分离能力的WT ZHX2上发生磷酸化，表明ZHX2相分离是其S625/S628位点磷酸化的先决条件。

将这两个位点突变为丙氨酸（SA突变体）后，ZHX2与CTCF的相互作用被完全阻断（D）。然而，SA突变体在缺氧时仍能正常发生相分离（形成斑点），但CTCF无法被招募到这些凝聚体中（E）。功能上，SA突变体无法恢复缺失ZHX2后导致的染色质环形成和靶基因（125个相分离基因）的下调（F）。

在细胞迁移、侵袭实验以及小鼠肺转移模型中，PA突变体（丧失PS）和SA突变体（丧失CTCF招募）均丧失了促进转移的能力（A-F）。

该研究提出了一个精细的调控模型：在缺氧条件下，ZHX2首先通过其富含脯氨酸的IDR发生相分离，形成核内凝聚体。这种相分离状态作为平台，一方面招募了MED1、BRD4和RNA Pol II等转录共激活因子；另一方面，它促进了ZHX2自身的S625和S628位点磷酸化。磷酸化的ZHX2进而获得了与CTCF结合的能力，将CTCF招募到凝聚体中。最终，ZHX2-CTCF轴在凝聚体内重塑了染色质高级结构，形成了新的增强子-启动子环（E-P looping），高效激活了包括MYC在内的一系列转移相关癌基因，驱动癌症进展。该机制揭示了染色质环如何动态响应氧气变化，并为靶向ZHX2-CTCF轴提供了新的癌症治疗思路。