这项研究首次阐明ecDNA作为"移动增强子"调控癌症基因组的精确分子机制。研究团队通过单分子染色质互作分析、表观基因组学和CRISPR表观编辑等前沿技术，在三种癌症模型中证实：ecDNA携带的超级增强子可招募MED1等转录因子，通过液-液相分离形成核凝聚体，这些凝聚体充当转录枢纽，与数千个染色体基因建立远程互作，反式激活71%的已知癌基因。此外，研究发现破坏ecDNA超级增强子活性或解聚MED1凝聚体，可显著抑制癌细胞增殖并诱导凋亡，为开发靶向ecDNA的新型癌症治疗策略提供了重要靶点和概念验证。

研究利用ChIA-drop技术在三种癌症模型（前列腺癌PC3 DM、结直肠癌COLO320 DM和胶质母细胞瘤GBM171 DM）中系统绘制了ecDNA-染色体互作图谱。ChIA-drop利用微流控技术将单个染色质复合物分配到独立液滴中进行条形码标记，实现了单分子分辨率的多重染色质接触分析。结果显示，三种癌症模型中分别鉴定出14,810、25,876和3,775个ecDNA-染色体接触位点，这些接触位点高度富集MED1结合和H3K27ac活性标记。

通过Casilio活细胞成像技术验证，ecDNA在细胞核内形成离散的荧光斑点，这些斑点与MED1蛋白免疫荧光信号高度重叠，证实ecDNA聚集体是MED1核凝聚体的组成部分。

在所有三种癌症中共鉴定出2,299个核心染色体靶基因被ecDNA连接，其中71%的已知癌基因（来自COSMIC和NCG数据库的3,447个癌基因）是ecDNA的互作靶标。不同癌症模型展现出特异性的ecDNA连接模式：在PC3 DM和GBM171 DM中，单个ecDNA超级增强子（ecSE）可独立调控多个基因；而在COLO320 DM中，94%的靶基因同时连接到多个ecSE，呈现协同激活模式。

通过整合UMI策略的ChIP-seq分析校正拷贝数偏差后，研究在三种癌症中分别鉴定出13、23和24个ecSE。这些ecSE的MED1结合强度比典型染色体增强子高一个数量级，且在全局超级增强子中排名靠前。染色质互作分析显示，仅少数高连接性ecSE作为枢纽，汇聚了绝大多数ecDNA介导的染色质接触，而这些ecSE在染色体同源位点几乎不产生类似的远程互作。

HOMER motif分析揭示，ecDNA-染色体接触区域的MED1结合位点显著富集ELK1和NRF1转录因子结合基序（富集倍数分别为2.3和4.7），提示这些转录因子参与招募MED1到ecDNA染色质复合物。通过Casilio-imaging技术对ChIA-drop鉴定的靶位点进行正交验证，发现ecDNA与靶基因的空间距离显著小于随机对照位点（Wilcoxon秩和检验p<0.05），确认了ecDNA-染色体接触的特异性。

为验证ecDNA聚集体的凝聚体特性，研究使用1,6-己二醇（1,6-HD）处理细胞并通过Casilio活细胞成像追踪ecDNA动态变化。结果显示，1,6-HD处理后ecDNA荧光斑点信号迅速消失，而同一染色体上ecDNA起源位点的荧光信号不受影响。不同癌症模型的ecDNA凝聚体对1,6-HD的响应动力学存在差异：PC3 DM和GBM171 DM细胞中ecDNA斑点在1小时内完全消失，而COLO320 DM细胞中需要155分钟后仍有部分信号残留（A）。qPCR验证确认1,6-HD处理不改变ecDNA拷贝数（B）。

ChIP-seq分析结果显示，1,6-HD处理后ecDNA上的MED1结合显著下降，且下降幅度显著高于染色体超级增强子和非超级增强子区域（B，C）。ChIA-drop分析进一步揭示，1,6-HD处理导致ecDNA-染色体互作网络快速瓦解，ecDNA介导的染色质接触数量大幅减少（D）。这些结果表明，MED1凝聚体是维持ecDNA聚集和染色质互作网络的结构基础。

为建立ecDNA增强子与靶基因表达的因果关系，研究采用Casilio-i系统（CRISPR介导的表观沉默技术）特异性失活ecSE。该系统利用dCas9-KRAB融合蛋白和多条sgRNA靶向ecSE区域，诱导局部异染色质化而不改变DNA序列。在PC3 DM细胞中，针对ecSE1（ecDNA上连接性最高的超级增强子）设计了8条sgRNA进行表观沉默。

CUT&Tag分析结果显示，Casilio-i处理后ecSE1区域的H3K27ac活性标记显著下降，而染色体同源位点不受影响，证实了靶向沉默的特异性。

RNA-seq分析表明，ecSE1沉默导致其直接连接的染色体靶基因表达下降40-60%，包括多个癌症相关基因如NBEAL2、CCDC12等。

ChIA-drop分析进一步证实，ecSE1沉默后其介导的ecDNA-染色体互作显著减少，而其他未被靶向的ecSE的互作网络基本保持不变。这些结果直接证明了ecDNA超级增强子对靶基因转录激活的因果作用。

研究通过功能实验评估了干预ecDNA凝聚体或增强子活性对癌细胞行为的影响。1,6-HD处理在所有三种癌症模型中均导致细胞增殖显著减少50%以上（CCK-8增殖实验），并诱导细胞凋亡增加2-3倍（Annexin V/PI流式分析）。

类似地，Casilio-i介导的ecSE1表观沉默在PC3 DM细胞中同样显著抑制细胞增殖并促进凋亡。

转录组分析结果显示，1,6-HD或Casilio-i处理后，ecDNA靶基因的表达普遍下调，尤其是参与细胞周期、DNA复制和癌症信号通路的基因。GSEA富集分析结果表明，下调基因显著富集在MYC靶基因、E2F靶基因和G2/M检查点等促增殖通路。Western blot验证了关键癌基因如MYC、MDM4和EGFR的蛋白水平在处理后显著降低。这些结果证实，破坏ecDNA凝聚体结构或失活其超级增强子可有效抑制癌基因表达网络，从而抑制肿瘤细胞生长。

为验证ecSE活性对ecDNA凝聚体形成的重要性，研究通过活细胞成像观察了Casilio-i处理对ecDNA凝聚体的影响。在稳定表达靶向ecSE1或ecSE2的sgRNA的PC3 DM和COLO320 DM细胞中，Dox诱导后含有ecMYC荧光斑点的细胞核数量显著减少，减少幅度高达4倍（E）。qPCR验证确认这种荧光斑点的消失并非由于ecDNA分子的降解，因为Casilio-i处理不影响ecDNA拷贝数（C）。

ChIATAC分析证实，ecSE沉默后ecDNA介导的顺式（ecDNA间）和反式（ecDNA-染色体间）互作频率显著降低（A）。以DNMT3B和CDCA5为例，当所有四个ecSE被沉默后，这些ecSE1靶基因失去了与ecDNA的所有互作，其表达分别下降60%和72%（B-D）。

功能实验显示，ecSE1或ecSE2沉默显著抑制PC3 DM细胞增殖，在4天的对数生长期内增殖率降低超过50%，其中ecSE1扰动的抑制效应更为显著（图5F）。转录组分析表明，ecSE沉默主要影响参与DNA复制、染色质组织调控和核糖体生物合成的基因功能。

这些结果表明，ecDNA超级增强子的活性是维持ecDNA凝聚体形成和促进肿瘤细胞增殖的关键因素。通过破坏ecSE-MED1结合，可以有效瓦解ecDNA凝聚体结构，阻断其反式激活功能，从而抑制肿瘤细胞生长。

该研究通过整合ChIA-Drop、Casilio双色成像、表观编辑和化学扰动等技术，建立了ecDNA-MED1凝聚体驱动癌基因转录的结构-功能模型：ecDNA通过ecSE招募MED1形成相分离凝聚体，在核内建立转录活性区室；这些凝聚体作为枢纽与特定染色体基因建立多重接触，协同激活包括癌基因在内的靶基因网络；破坏凝聚体或沉默ecSE均可瓦解这一调控架构，导致靶基因表达下调和细胞凋亡。该机制揭示了ecDNA如何通过重塑三维基因组结构驱动肿瘤异质性和演化，为开发针对ecDNA增强子的癌症治疗策略提供了理论基础。

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