Gibson无缝连接试剂盒：Epi™ 2×HiFi Gibson Assemble Mix Kit

Gibson组装是一种等温无缝克隆方法，能够高效的组装多个DNA片段，将一个或多个插入片段定向、快速、准确地插入到线性化载体中，最终构建的重组克隆无任何额外的碱基序列残留。

表观生物Epi™ 2×HiFi Gibson Assemble Mix kit，可实现高保真、高稳定性、高效、简便的DNA连接效果，适用于大量文库构建、蛋白表达等场景。

产品信息

技术原理

Gibso 组装没有酶切位点的限制，线性化载体可通过限制性内切酶酶切或通过 PCR 的方法直接制备，在插入片段的两个 PCR 引物的 5' 端引入与载体克隆位点两端完全相同 15~25bp 的重叠序列充当同源臂。带有同源臂的插入片段和线性化载体按一定比例混合后，在重组酶的催化下，50℃反应 10 - 20min 即可转化。

图1. Gibson组装原理示意图

A）Giboson组装中的三种酶具体工作原理；B）单个插入片段组装；C）多个插入片段组装。彩色区块为同源臂，退火温度要高于 48℃。Gibson组装的反应体系包含T5核酸外切酶，高保真DNA聚合酶，和Taq DNA连接酶。T5核酸外切酶具有很强的5' → 3'的核酸外切酶活性，酶切克隆片段产生3'端突出的粘性末端，同源末端之间会进行碱基互补配对，随后高保真DNA聚合酶按照5' → 3'方向填补间隙。Taq DNA连接酶在缺刻处将5'磷酸和3'羟基连成磷酸二酯键

产品亮点

1. 高保真性：克隆准确率>95%，所见即所得

2. 高稳定性：液态的Mix,避免反复冻融，避免酶活损失

3. 高效：克隆数目多，可用于大容量文库的构建

4. 简便：Mix和样品等体积混匀即可

产品应用

1. DNA连接

2. 分子克隆

3. 蛋白表达

4. 定点突变

5. 小基因组组装

实测数据

注意事项

1. 载体和插入片段的摩尔之比介于1：2之间；

2. 同源臂的长度推荐为15~40 bp，引物融解温度要高于50℃；

3. 载体要线性化，PCR获得载体时，最好用DpnI消化模板，防止干扰下游实验；

4. 单个插入片段的PCR产物进行重组反应时，若条带单一，无须纯化可直接进行重组反应，但PCR产物的体积不得超过重组反应体系的20%，重组效率通常会低于纯化后的PCR产物；

5. 多片段重组反应，最好切胶回收载体和插入片段。

应用案例

Nat Microbiol：KorB蛋白如何从DNA滑动夹转变为长程基因沉默的抑制因子（DOI: 10.1038/s41564-024-01915-3）

这篇文章揭示了多重耐药质粒RK2中KorB蛋白的新机制：KorB作为CTP依赖的DNA滑动钳，能在DNA上滑行到达远距离目标启动子。KorA蛋白通过锁定KorB的闭合钳状态，将其从滑动钳转换为转录抑制子，实现长距离基因沉默。这种机制为细菌长距离转录调控提供了新的分子基础，有助于理解多重耐药质粒的调控网络。

图1. 该研究使用Gibson组装在质粒构建过程中进行DNA片段连接；构建了多种质粒用于后续的蛋白表达和功能研究