mRNA m5C BS-seq技术服务,绘制单碱基分辨率m5C修饰图谱
项目简介
m5C是RNA甲基化修饰中丰度较低的一种类型,但在肿瘤中的研究进展已经引起了广泛关注。近年来,随着高通量测序技术的发展,可以在转录组中很好的识别对包括m5C在内的各种核苷酸甲基化修饰。m5C修饰可以影响RNA的稳定性、可变剪接、翻译和转录后修饰等多个方面,从而对基因表达和细胞功能产生影响。虽然有大量关于m5C在tRNA和rRNA中的数据,但由于mRNA的丰度较低,且缺乏有效的分离纯化技术,对其在mRNA中的作用知之甚少。
为了推动mRNA m5C修饰研究,表观生物最新推出单碱基分辨率的mRNA m5C BS-seq技术服务。该技术使用重亚硫酸盐对不含修饰的C进行处理,使其在PCR之后转换为T,而m5C修饰并不能进行该转换。结合体外合成全转录组无修饰RNA技术,在mRNA m5C BS-seq中加入IVT RNA作为负对照,得到高置信度的m5C位点,降低了检测结果中的假阳性率。
技术流程
分析内容
m5C BS-seq
1. 原始数据过滤、质控
2. 参考基因组比对
3. Peak calling
4. Peak注释
5. GO富集分析
6. KEGG富集分析
7. Motifs分析
8. 信号矩阵分析(Peak热图)
9. CIMS 分析
10. 可视化文件
11. 差异分析(如果有多组样品,进行差异分析,找出差异结合位点)
mRNA
1. 测序原始reads去接头,质量控制
2. 参考基因组比对
3. 基因表达定量分析
4. 基因注释
5. 差异表达分析
6. 差异基因热图绘制(仅限有生物学重复)
7. 差异基因GO分析
8. 差异基因KEGG分析
送样要求
仅限人、大小鼠,其他物种需评估
样本类型:
需要富集polyA mRNA
Total RNA:50ug/样本
细胞:1.5*10⁷ 个细胞/样本
组织:25 mg/样本
2个月(A-B)和6个月大(C-D)时,Nsun5KO和WT小鼠卵巢m5C水平的Pearson相关性热图(A)和总体水平的小提琴图(B)
研究案例
Clin Transl Med:Nsun5/m5C介导的母源mRNA调控—卵巢衰老和胚胎发育的关键[2]
这项研究揭示了RNA甲基转移酶Nsun5及其介导的m5C修饰在调节卵巢功能和胚胎发育中的关键作用。研究人员利用Nsun5敲除(Nsun5KO)小鼠模型,并结合m5C-BS-seq、IF、WB和荧光素酶报告基因检测等技术,研究了Nsun5缺失的影响。对不同年龄Nsun5KO和野生型小鼠卵巢的m5C-BS-seq分析显示,与衰老相关的Nsun5KO小鼠m5C水平总体下降。值得注意的是,与卵母细胞成熟和生育能力相关的关键基因,如Mad2l2和Gdf9,在Nsun5KO小鼠中表现出m5C水平降低和蛋白质表达减少。进一步的研究证实了Nsun5与这些靶基因之间存在直接的相互作用。还发现Nsun5参与了对卵母细胞发育的调控。这些发现突出了Nsun5/m5C在控制母源mRNA稳定性方面的新调控轴,为了解卵巢衰老和早期胚胎发育的机制提供了重要的见解。
重叠m5C基因的GO富集分析
韦恩图显示了2个月和6个月时,KO/WT比率小于0.8的m5C基因的重叠
参考文献
[1]Zhang Z, Chen T, Chen HX, et al. Systematic calibration of epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library. Nat Methods. 2021;18(10):1213-1222.
[2]Ding C, Lu J, Li J, et al. RNA-methyltransferase Nsun5 controls the maternal-to-zygotic transition by regulating maternal mRNA stability. Clin Transl Med. 2022;12(12):e1137.