SUMMER

研究团队设计了五层次递进式研究策略：

• FRET成像发现：利用代谢标记（Ac₄GlcNAz）结合点击化学，将荧光受体（Cy3）标记到GlcNAc上，同时用FAM标记的DNA探针识别Y5 RNA，通过FRET信号初步证实GlcNAc-Y5 RNA的存在及其核内分布。

• 磁珠捕获验证：设计生物素化捕获探针（Cap-Y5），通过链霉亲和素磁珠特异性富集细胞内Y5 RNA，结合DBCO-FAM点击标记，验证GlcNAc修饰的存在。

• 酶学性质解析：利用GlcNAcase、O-糖苷酶和PNGase F等工具酶，结合PAGE分析和FRET成像，鉴定修饰类型为GlcNAc单糖而非复杂N-聚糖或O-聚糖。

• 质谱结构确认：通过MALDI-TOF和高分辨Orbitrap质谱，鉴定GlcNAc-核糖核苷酸缀合物的特征分子离子峰（m/z 537.48），并利用Ac₄GlcNAz代谢标记产生的质量漂移进一步确认。

• 原位精准定量：开发GlcISH-PLA方法，结合STED超分辨成像，首次实现单细胞水平GlcNAc-Y5 RNA的绝对定量（例如，HeLa细胞约12个信号点/细胞）。

一、FRET成像揭示细胞内GlcNAc-Y5 RNA的存在与核内分布

研究团队首先构建了FRET成像系统（图1）。将HeLa细胞与Ac₄GlcNAz或Ac₄ManNAz共孵育进行代谢标记，经RNase处理彻底去除细胞表面RNA干扰后，利用DBCO-Cy3标记含叠氮的糖基，FAM-DNA探针（Com-Y5-1）识别Y5 RNA。结果显示，Ac₄GlcNAz标记的细胞表现出明显的FRET信号（FAM→Cy3），而Ac₄ManNAz标记组仅显示微弱的Cy3荧光且无FRET信号，表明细胞内Y5 RNA携带GlcNAc修饰而非唾液酸。

Y5 RNA敲除实验和GlcNAc合成抑制剂（DON）处理实验进一步确认了FRET信号的特异性。有趣的是，当使用FAM标记位置不同的Com-Y5-2至Com-Y5-8探针时，仅Com-Y5-1和Com-Y5-5（FAM标记位置相近）产生强FRET信号，说明GlcNAc修饰位点位于Y5 RNA的特定区域。

通过ER-Red、Golgi-Red和Hoechst 33342共定位分析（图2），研究团队发现GlcNAc-Y5 RNA主要分布于细胞核（Pearson系数0.872），而在内质网（0.328）和高尔基体（0.465）中的分布较低。

二、磁珠捕获策略验证GlcNAc-Y5 RNA

研究团队设计了生物素化的Cap-Y5探针，通过链霉亲和素磁珠从总RNA中特异性捕获Y5 RNA（图3）。CLSM成像显示，从Ac₄GlcNAz标记细胞提取的携带Y5 RNA的磁珠经DBCO-FAM标记后呈现强FAM荧光，而从未标记或Ac₄ManNAz标记细胞捕获的磁珠样品则无信号。PAGE分析显示，细胞内来源的Y5 RNA迁移速率显著慢于合成Y5 RNA（Syn-Y5），说明其携带额外修饰基团。该现象在HaCaT、MCF-7和MCF-10A细胞中均得到验证。

三、酶学鉴定确认GlcNAc单糖修饰

利用GlcNAcase、O-糖苷酶和PNGase F三种糖苷酶分别处理标记细胞（图4），FRET成像显示仅GlcNAcase处理组FRET信号显著消失，FAM信号不受影响；O-糖苷酶和PNGase F处理组FRET信号无明显变化。PAGE分析进一步证实，GlcNAcase处理使Y5 RNA的迁移速率加快至接近Syn-Y5水平，且荧光电泳的DBCO-FAM荧光信号消失。这些结果充分证明Y5 RNA携带的是GlcNAc单糖，而非N-聚糖或O-聚糖。

四、Y3/Y4 RNA选择性：GlcNAc修饰并非普适

为探究GlcNAc修饰是否为Y RNAs家族的普遍特征，研究团队分别针对Y3和Y4 RNA设计了Com-Y3-1和Com-Y4-1探针。FRET成像显示，Ac₄GlcNAz标记的细胞中Y3和Y4 RNA虽可被有效识别（FAM信号明显），但均无FRET信号（图5）。

磁珠捕获结合PAGE分析也证实，Y3和Y4 RNA无GlcNAc修饰。RNA测序进一步揭示，许多其他RNA（包括tRNA衍生小RNA、snoRNA和特定microRNA）同样携带GlcNAc修饰（补充图36），提示GlcNAc修饰具有广泛的RNA靶标选择性。

五、质谱分析确认GlcNAc-核糖核苷酸缀合物

通过MALDI-TOF和高分辨Orbitrap质谱分析（图6），RNase处理后的细胞内Y5 RNA在m/z 537.48处出现特征峰，而Syn-Y5中无此峰。Ac₄GlcNAz代谢标记使该峰移至m/z 578.48（质量偏移+41 Da，对应叠氮基团），而Ac₄ManNAz标记无此偏移，排除唾液酸修饰的可能。GlcNAcase处理使m/z 537.48峰消失，进一步确证其为GlcNAc-核糖核苷酸缀合物。MS/MS分析显示m/z 396.4的碎片峰，提示该缀合物包含AMP或其衍生物。

六、GlcISH-PLA实现单细胞精准定量

研究团队开发了GlcISH-PLA方法（图7），结合STED超分辨成像，对GlcNAc-Y5 RNA进行单细胞绝对定量。该方法利用双探针同时识别Y5 RNA和代谢标记的GlcNAz，通过邻近连接触发滚环扩增（RCA），每个靶标分子产生一个荧光扩增子（RCP），实现“一靶标一扩增子”的绝对定量。

定量结果显示，HeLa细胞中GlcNAc-Y5 RNA约为12.26个信号点/细胞；HaCaT细胞约19.54个；MCF-7约11.55个；MCF-10A约15.43个。BAG（O-GlcNAc转移酶抑制剂）和OSMI-1处理可显著降低扩增子数量（分别降至0.59和3.4个/细胞），证实GlcNAc修饰依赖OGT相关通路。蛋白酶K预处理不改变定量结果（12.05 vs 12.26个/细胞），排除了GlcNAc修饰蛋白产生假阳性信号的可能。