RNA甲基化是表观遗传学的重要内容之一，其中m⁶A是较为常见的一种修饰方式，在转录后调控中发挥作用，包括调控基因表达、剪接、RNA编辑、RNA稳定性、控制mRNA寿命和降解、介导环状 RNA翻译^[1]等方面，因此，RNA甲基化修饰的相关研究已成为当前生命科学领域最热门的方向之一。

       和细胞内的RNA/DNA一样，外泌体内的RNA/DNA也存在着甲基化修饰^[2]，且细胞本身的甲基化状态变化影响着外泌体成分，肿瘤细胞来源的外泌体中还含有肿瘤相关的DNA甲基化^[3]，有望成为外泌体液体活检肿瘤标志物。另一方面，近年来关于外泌体DNA甲基化的研究表明，外泌体可通过传递DNA甲基化或去甲基化相关因子调控受体细胞DNA甲基化，从而参与疾病的发生发展、组织再生、免疫调节以及器官形成等^[4-5]。

       表观生物把握表观遗传学与外泌体研究先机，率先推出外泌体RNA甲基化meRIP-seq整体高通量测序服务，两大热点相结合，提升研究高度和广度，深入揭示生理病理机制，挖掘外泌体液体活检潜在RNA甲基化疾病标志物！

 

技术应用

1.       绘制外泌体全转录组m⁶A修饰图谱；

2.       比较正常人血浆外泌体与患者血浆外泌体的RNA甲基化情况，筛选疾病标志物；

3.       研究（干）细胞上清外泌体RNA甲基化对受体细胞的作用机制；

4.       研究肿瘤细胞分泌外泌体对微环境的影响机制

 

项目流程

外泌体提取→外泌体RNA提取→ meRIP实验 →微量文库制备和测序

 

技术原理

表观生物采用来源于德国 QIAGEN 公司的独家技术——QIAGEN exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit 提取外泌体 RNA，广泛兼容细胞培养基上清、血清血浆及其他体液样本，能够在 20 分钟内快速纯化得到细胞外囊泡，一个小时内纯化得到外泌体 total RNA 分子，为后续 RNA 功能研究奠定基础。

甲基化RNA免疫共沉淀（methylated RNA Immunoprecipitation，meRIP）基于抗体特异性结合甲基化修饰的碱基的原理，以RNA免疫共沉淀富集甲基化修饰片段为基础，然后通过高通量测序，在全转录组范围内研究发生甲基化的RNA区域，高效获得结果。

 

图1. 微量meRIP实验流程图

 

送样要求

样本类型：人血浆样本≥8mL

                细胞培养上清≥60ml

 

测序方案

测序平台：Illumina Nova Seq 6000

测序模式：PE150

测序数据：12G

 

基本分析内容 
1、 原始数据过滤及质控
2、参考基因组比对
3、Reads在染色体上的分布
4、Peak Calling 分析
5、Peak 可视化
6、Peak 统计分析
7、m6A 的基本特征
    7.1 peak 在基因元件的分布
    7.2 reads 在基因元件的分布
    7.3 Peak 关联基因的特征 
8、差异m6A修饰位点分析

9、差异m6A修饰相关编码蛋白基因GO，KEGG分析 10、差异m6A修饰相关lncRNA分析
11、 motif分析 

高级分析内容
RNA-seq表达差异与m⁶A修饰差异关联分析

RNA可变剪切与m⁶A修饰差异关联分析

 

实测数据

图2. 表观生物微量meRIP-seq结果，显示meRIP数据在3’ UTR有显著富集

 

图3. 实测数据显示m⁶A修饰位点富集于转录终止区域

图4. 实测数据显示某特定基因的m⁶A修饰区域

 

参考文献：

1. Zhou C, Molinie B, Daneshvar K, et al. Identification and characterization of m6A circular RNA epitranscriptomes[J]. bioRxiv, 2017: 115899.

2. Thakur BK, Zhang H, Becker A, et al. Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection. Cell Res. 2014 Jun;24(6):766-9.

3. Yamamoto H, Watanabe Y, Oikawa R, et al. BARHL2 Methylation Using Gastric Wash DNA or Gastric Juice Exosomal DNA is a Useful Marker For Early Detection of Gastric Cancer in an H. pylori-Independent Manner. Clin Transl Gastroenterol. 2016 Jul 21;7(7):e184.

4. Shen N, Jiang L, Li Q, et al.The epigenetic effect of microRNA in BCR-ABL1 positive microvesicles during the transformation of normal hematopoietic transplants[J]. Oncol Rep,2017,38(5): 3278-3284.

5. Hayashi T, Lombaert IM, Hauser BR, et al. Exosomal MicroRNA Transport from Salivary Mesenchyme Regulates Epithelial Progenitor Expansion during Organogenesis. Dev Cell. 2017 Jan 9;40(1):95-103.