LACE-seq
项目简介
非编码 RNA（ncRNA）与人类多种生理过程以及疾病发生发展息息相关，但 ncRNA 发挥功能需要复杂的高级结构以
及 RNA 结合蛋白（RBP）的介导，寻找介导 ncRNA 作用的 RBP，是理解相关的人类生理或致病机制的关键，也是难点。
作为研究 RNA 结合蛋白靶标的新方法，LACE-seq 能够对微量样本进行 RBP 作用位点的精确鉴定，达到单碱基分辨率，
样本量可低至单细胞水平！
技术原理
首先紫外交联细胞，用抗体孵育的磁珠富集蛋白质 -RNA复合物，MNase 处理，将 RNA 切成单个 RBP 关联的短片段；3’端去磷酸化，加接头；用含有 T7 启动子的生物素化引物进行逆转录，逆转录酶会在完整的 RBP-RNA 交联位点之前有效地停止，从而鉴定特定的 RBP 的结合位点下游的 3'端序列。
应用与优势
技术应用
1. 寻找介导 ncRNA 作用的 RBP，探究非编码区突变致病机制
2. 珍贵临床样本的 RNA 结合蛋白靶标搜寻
3. 深究早期生殖和胚胎发育过程中 RBP 的调控机制
技术优势
1. 精确鉴定 RBP 作用位点，达到单碱基分辨率
2. 所需样本量少，可低至单细胞水平，适用于稀有样本、临床样本
3. 与 CLIP-seq 等技术相比，特异性、敏感性更高
送样要求
样本物种： 仅限人、大小鼠，其他物种需评估
活细胞，≥ 5 万个细胞 / 样本，细胞存活率≥ 85%
样本类型
紫外交联细胞沉淀≥ 5 万个细胞 / 样本，细胞存活率≥ 85%
分析内容
1. 测序原始 reads 去接头，质量控制（QC）
2. 参考基因组比对（Mapping）
3. 富集区域鉴定（PeakCallling）
4. 富集区域注释（PeakAnno）
5. Motif 分析（motif）
6. 差异 Peak 分析
7. 差异 Peak 基因 GO 和 KEGG 分析
图 3-56. 蛋白 - RNA 互作的 RNA 类型图
表观生物实测数据
图 3-57. 差异 RNA 火山图
图 3-58. 蛋白 - RNA 互作网络
图 3-60. 特定蛋白的 motif 分析
图 3-61. Ago2 组、Mili 组、Ptbp1 组还有 IgG 组的 LACE-seq 差异表达热图
参考案例
案例： Nat Cell Biol：通过 LACE-seq 绘制 RNA 结合蛋白靶位点的全局图谱 [9]
研究者对数十个小鼠中期 II (MII) 卵母细胞分别进行多个 RBP 的 LACE-seq 靶基因分析，发现与 Ago2 共沉淀的 RNA
与阴性对照组（IgG 组）、Ptbp1 组有显著差异，但与 Mili （属于 Argonaute 蛋白家族）共沉淀的 RNA 相似；进一步研究发现， Ago2/endo-siRNA 沉默复合物在卵细胞中以非完全互补配对的方式抑制 mRNA 的翻译，endo-siRNA 的靶标Bub3、Chk1、Nuf2 等的蛋白质水平变化可能与 Ago2 敲除后的表型相关；此外，还证明了 Ago2/endo-siRNA 复合物可切割由逆转座子启动子起始的嵌合体 RNA。综上所述，Ago2 与 endo-siRNAs 结合，介导抑制 LTR 驱动的嵌合转录物，发挥着类似 miRNA 的抑制 mRNA 翻译的功能，确保了卵细胞中转录组的完整性。
图2 结构域的解析
图 3-62. LACE-seq、RNA-seq、small RNA-seq联合分析，发现 Ago2/endo-siRNA 沉默复合物结合了许多内含子 LTR 逆转座子，如 MTA