Ribo-seq核糖体印迹测序服务
项目简介
Ribo-seq核糖体印迹测序服务
蛋白质是生命活动的主要承担者。根据中心法则，从基因组生成整个蛋白质组需要有RNA生成调控（含表观遗传调控和转录调控）、RNA降解调控、蛋白质生成调控（即翻译调 控）、蛋白质降解调控这四个主要调控阶段。其中, 翻译调控占所有调控比例的一半以上，超过其他所有调控的总和，是细胞内最重要的调控方式[1]。翻译组学针对的是对生命过程全局性研究的主要矛盾，从翻译组学的角度研究问题，可谓是研究中心法则的生物核心信息流。
Ribo-seq (Ribosome profiling)，即核糖体印迹测序技术，系由Weissman课题组于2009年首次发表的翻译组学研究技术[2]。利用Ribo-seq，研究者能从基因组水平检测蛋白质的翻译状况，获得全面的、高质量的蛋白质翻译速度情况，了解蛋白质表达情况及其丰度；还能直接对翻译过程进行研究。
实验流程
首先，用翻译抑制剂或液氮急冻处理细胞或组织。核酸酶处理，使不受保护的RNA降解。回收核糖体，通过序列大小选择性回收RFP片段，然后制备文库，进行二代测序。将reads与基因组比对，找到它们在核糖体的位置。
技术原理
利用低浓度RNase处理核糖体—新生肽链复合物，降解没有核糖体覆盖的mRNA片段，随后再去除核糖体，通过二代测序技术检测被核糖体保护的约22~30 bp的RNA小片段 (称为ribosome footprints，RFPs；又称ribosome protected fragments，RPFs。两者等价)，可得到核糖体分布的位置信息，据此可得到每种转录本上核糖体的分布、密度，可推测起始密码子位置（包括非ATG起始）、ORF（开放阅读框）位置、翻译暂停区域以及uORFs （上游开放阅读框）等信息[3]。
(A) 翻译延长速率越慢，核糖体停留的时间越多；(B)细胞内所有组装好的核糖体的“快照”(snapshot)；(C)核糖体足迹(footprints)密度越高的位点，表明翻译延长速率越慢。
送样要求
样品分组 ： 1. 常规要求至少2组样品，包括对照组和实验组（临床样本为正常人组和患者组）。 2. 每个样品均进行 Ribo-seq 和 longRNA-seq (采用去rRNA建库法)。 3. 样本数建议：3 VS 3。
≥1×10^7
活细胞样本密度
≥300mg
组织样本质量
人、大小鼠
样本物种
应用与方案
技术应用
联合longRNA-seq，研究转录本上正在进行的翻译情况，深入了解基因调控最重要层面：
1.了解转录本上的核糖体分布、翻译活性
2.推测翻译起始位点、ORF位置
3.确定蛋白翻译效率
4.探究翻译调控和基因表达情况
5.鉴定具有翻译能力的 lncRNA 和 circRNA
测序方案
1. 测序平台：Illumina NextSeq CN500/NovaSeq 6000
2. 测序模式：SE 75
3. 测序数据量： 40M
分析内容
实测数据及分析结果示例 1
图3. 表观生物通过K562细胞 Ribo-seq，下机质控数据显示具有显著的3nt周期特征，数据质量优异。 质控数据没有显著的3nt周期特征，可免费重做！
实测数据及分析结果示例 2
ORF类型分布图
实测数据及分析结果示例 3
翻译效率累积分布曲线
实测数据及分析结果示例 4
密码子使用频率分布图
实测数据及分析结果示例 5
肿瘤新生抗原分析预测（图片来自Genocea poster）
Ribo-seq检测tRNA^Glu uuc 和tRNA^Arg ccG上调后的转录后水平特征
参考案例
Cell—特异tRNA促进肿瘤转移[5]
该研究发现，在人类乳腺癌中，特殊的tRNAs：tRNAGluUUC 和tRNAArgCCG的表达水平上升会使细胞获得转移能力。研究者通过Ribo-seq检测这些特殊tRNAs增多后转录本上的核糖体结合情况，结果显示富集这些tRNA同源密码子的转录本更加稳定，核糖体结合更多。特别是tRNAGluUUC通过直接增强EXOSC2表达与增强GRIPAP1来构成一条受tRNA驱使的“可诱导”通路，从而促进癌症转移。
(A)Ribo-seq文库的标志性特征：周期为3nt；(B)RPF长度为30nt；(C)Ribo-seq分析结果显示，在tRNAGluUUC 和tRNAArgCCG过表达的细胞中，核糖体结合增加，含GAR和CGG的基因显著富集；(D)质谱分析显示，在tRNAGluUUC过表达细胞中，GAG和GAA (GAR)丰度高的基因显著富集。
参考文献
[1]Sun Y M, Wang W T, Zeng Z C, et al. CircMYBL2, a circRNA from MYBL2, regulates FLT3 translation by recruiting PTBP1 to promote FLT3-ITD AML progression[J]. Blood, 2019, 134(18): 1533-1546.（合作客户文章）
[2] Schwanhausser B, Busse D, Li N, et al. Global quanti- fication of mammalian gene expression control. Nature, 2011, 473(7347): 337-342
[3] Ingolia NT, Ghaemmaghami S, Newman JR, et al. Ge- nome-wide analysis in vivo of translation with nucleo- tide resolution using ribosome profiling. Science, 2009, 324(5924): 218-223
[4] Ingolia NT. Ribosome Footprint Profiling of Translation throughout the Genome. Cell, 2016, 165(1): 22-33
[5] Gobet C, Naef F. Ribosome profiling and dynamic regulation of translation in mammals. Curr Opin Genet Dev. 2017 Apr;43:120-127.
[6] Goodarzi H, Nguyen H C B, Zhang S, et al. Modulated Expression of Specific tRNAs Drives Gene Expression and Cancer Progression[J]. Cell, 2016, 165(6): 1416-1427.
[7] Weng H, Huang F, Yu Z,et al. The mA reader IGF2BP2 regulates glutamine metabolism and represents a therapeutic target in acute myeloid leukemia.Cancer Cell 2022 Oct 26 （客户文章）
[8] Sun YM, Wang WT, Zeng ZC, et al. circMYBL2, a circRNA from MYBL2, regulates FLT3 translation by recruiting PTBP1to promote FLT3-ITD AML progression. Blood. 2019 Oct 31;134(18):1533-1546.]（客户文章）
[9] ChenH, Gao S, Liu W,et al. RNA N-Methyladenosine Methyltransferase METTL3 Facilitates Colorectal Cancer by Activating the mA-GLUT1-mTORC1 Axis and Is a Therapeutic Target. Gastroenterology 2021 03;160(4). （客户文章）
[10] Wei R, Cui X, Min J, et al. NAT10 promotes cell proliferation by acetylating CEP170 mRNA to enhance translation efficiency in multiple myeloma. Acta Pharm Sin B. 2022 Aug; 12(8): 3313–3325. （客户文章）