PE系统的核心组成：

Cas9 nickase：只切割非靶标链（NTS），产生单链缺口而非DSB，大幅降低非预期突变风险。

M-MLV逆转录酶：融合在Cas9的C端或N端，负责以pegRNA为模板合成含编辑信息的新DNA链。

pegRNA：这是PE系统的灵魂，它同时承担靶向定位和携带修复模板的双重功能。除常规的spacer和scaffold外，还包含两个关键区域：

• PBS（primer binding site）：与缺口下游序列互补，锚定RT起始位置；

• RTT（reverse transcriptionase template）：目标编辑序列及同源臂（HA）。

编辑时，Cas9在非靶标链引入单链切口，暴露的3'末端与PBS杂交并启动逆转录，生成含有编辑信息的3' DNA flap；该flap与野生型5' flap竞争退火，最终通过细胞修复将编辑整合至双链（B-D）。为提升效率，可引入第二条sgRNA在互补链对应位置切口（PE3策略），促进编辑链作为修复模板（E-F）。

PE的系统优化策略

1、pegRNA设计优化

• 长度参数：PBS约13 nt、RTT约12 nt通常可获得最优性能，但需针对不同位点进行调整；

• epegRNA：在pegRNA 3'端引入结构化RNA假结（evoPreQ1 motif），有效保护其免受3'外切酶降解，编辑精度提升3–4倍；

• PE7系统：将外切酶保护因子La蛋白融合至PEmax，进一步稳定pegRNA的3' polyU尾，多位点效率显著提升；

• 化学修饰：2'-O-甲基化或无碱基间隔修饰可抑制逆转录过延伸至scaffold区域，减少非预期序列插入；

• 上游编辑扩展：EXPERT系统、actRNA:t策略及CiPEs（环化pegRNA）等，将编辑范围从切口下游延伸至上游，支持最长约100 bp的插入或替换。

2、DNA修复通路调控

• MMR（错配修复）抑制：MMR是限制PE效率的关键障碍。通过引入显性负性变体MLH1dn（即PE4/PE5系统）、shRNA敲低或基因敲除等方式抑制MLH1/PMS2，可将编辑效率提升2–7.7倍；

• RTT设计规避MMR：编辑长度>13 bp或在特定位置引入错配碱基，可有效逃避MMR识别；

• dNTP供给：在静止期或原代细胞中，抑制SAMHD1（dNTP水解酶）并补充外源核苷酸，可恢复RT活性，提升编辑效率；

• 5'外切酶辅助：Exo-PE系统利用T5 5'-3'外切酶降解竞争性5' WT flap，促进编辑链整合，在植物细胞中效率提升1.7–2.9倍；

• 染色质可及性：CRISPRa介导的靶位点激活可在特定背景下增强PE效率。

3、核定位与蛋白工程

• NLS优化：PEmax（N端+RT接头+双C端NLS）、PE*（双端NLS）和iPE（多NLS组合）均显著优于标准PE，PEmax在HeLa细胞中效率提升2.8倍；

• 定向进化：酵母OrthoRep系统进化获得的PE_Y18，精确编辑活性较PEmax提升约3.5倍；噬菌体辅助连续进化（PACE）筛选出的PE6系列变体，在尺寸或效率上均有显著改善；

• RT截短：删除M-MLV RT的RNaseH结构域，可将PE尺寸缩减约600 bp，同时不损失活性，利于AAV递送。

4、PAM识别扩展

• 工程化Cas9变体（Cas9-VQR、SpG-Cas9、SpRY-Cas9等）大幅拓展了PAM识别范围，SpRY接近无PAM限制状态，使PE可覆盖约95%的致病变异；

• Cas12a适配PE系统，利用其T-rich PAM偏好（TTTV），并支持pegRNA环化与模块化设计，实现多达4个位点的多重编辑。

PE平台

1、PEnuc（核酸酶型PE）

nCas9替换为野生型SpCas9核酸酶引入DSB而非单链切口。

优势：在MMR proficient细胞、静息细胞及受精卵中编辑活性显著更高（2-4倍提升），且可规避MMR监控。

劣势：产生部分模板重复（PTD）等不精确产物；但通过抑制DNA-PK或53BP1可显著提升精确性（精确编辑提升4-8倍）。

2、双pegRNA系统

使用两条pegRNA分别在互补链上生成相互补的RTT，通过退火"桥接"稳定编辑区域。

代表性平台：

• HOPE：在HEK293T和结肠癌细胞中，比单pegRNA系统效率和精确性更高，可整合24 bp表位标签；

• PRIME-Del/Bi-PE/GRAND-PE/twinPE：实现高达10 kb的精准缺失，连接处精确性显著优于双sgRNA Cas9方法；twinPE结合外源dsDNA供体（prime assembly策略）可实现高达11 kb的精准插入；

• PEDAR/WT-PE/PETI：结合PEnuc与双pegRNA，实现Mb级别的缺失、倒位及染色体易位建模，为结构变异研究提供强大工具。

2、PEI（Prime Editor-Integrase）系统

将PE与位点特异性重组酶（如Bxb1丝氨酸重组酶）耦合，绕过RTT长度限制，实现千碱基级大片段插入。

• PASSIGE：先用twinPE安装attB位点，再由Bxb1整合携带attP的供体，在HEK293T细胞中attB安装效率达80%，5.6 kb供体整合效率约12-17%。

• PASTE：将Bxb1与PE3融合为单一蛋白，一步实现attB安装和供体整合，在原代肝细胞中36 kb供体整合效率达10-20%。

• eeBxb1（进化工程Bxb1）：使PASSIGE整合效率提升4.2倍，比PASTE平均高16倍。

PE的多元递送策略

1、体外递送

2、体内病毒递送

• AAV：临床记录最佳，但~4.8 kb包装限制不足以容纳完整PE（~6.3 kb）。通过split-intein策略（Rma intein在1105位切割）将Cas9拆分后在细胞内重组，结合RT RNaseH截短，实现双AAV递送。

代表性成果：小鼠皮质神经元编辑效率达40%（PE6b双AAV）。

• 腺病毒（AdV）：载量充足，可容纳完整PE。PE5max经AdV递送，在镰刀型细胞病小鼠模型中矫正43% HbS等位基因并实现表型救治；PE2在Dnmt1位点矫正率达58%，远超split-AAV的15%。

3、体内非病毒递送

• LNP体内递送PE mRNA：小鼠肝脏Pcsk9位点编辑率约8%（每周3次给药）；

• 斑马鱼胚胎微注射PE2 RNP：精确编辑率最高达30%；

• eVLP颅内注射：小鼠皮质Dnmt1位点矫正率约2%；视网膜下注射：rd6小鼠Mfrp位点矫正率约15%。

PE治疗应用全景

1、镰状细胞病（SCD）

突变：HBB c.20 A>T

• 体外PE3矫正HEK293T细胞HBB等位基因率达60%；

• 患者来源HSPCs经ex vivo PE3max处理后移植，红系谱系编辑维持稳定，表型获救；

• AdV体内递送PE5max：SCD小鼠模型HSC矫正率43%，indels极少，无脱靶活性。

2、杜氏肌营养不良症（DMD）

突变：ΔEx51

• PE3在ΔEx51 iPSC来源心肌细胞中实现54%等位基因矫正，抗肌萎缩蛋白表达恢复至正常的40%，并改善收缩功能；

• 双pegRNA WT-PE策略通过删除外显子17–55（覆盖大多数致病变异），提出"通用疗法"概念，HEK293T细胞效率约7%。

3、遗传性酪氨酸血症I型（HT1）

突变：FAH c.706 G>A

• 流体动力学注射PE3质粒：肝脏等位基因矫正率11.5%，FAH阳性肝细胞比例扩增至61%；

• split-AAV递送PE3：矫正率仅1.3%，但仍实现FAH蛋白稳健恢复。

4、Leber先天性黑蒙（LCA）

突变：Rpe65 c.130 C>T

• AAV递送PE2矫正Rpe65 c.130 C>T：视网膜色素上皮（RPE）细胞矫正率6.4%，视网膜电生理功能恢复；

• PE-SpRY双AAV视网膜下注射：视网膜细胞精确编辑率约70%，视觉功能显著恢复。

5、囊性纤维化

突变：CFTR ΔF508

系统：PE3/PE5/PE6c

气道上皮细胞中高达58%矫正

PE完成首次人体临床试验

就在2026年3月，NEJM杂志报道了全球首例PE人体临床试验。针对慢性肉芽肿病（CGD）的自体HSPC编辑疗法【2】

治疗产品PM359的制备流程：

• 采集患者自体CD34 + HSPCs；

• 电转PE3 mRNA + 化学修饰epegRNA + sgRNA，体外矫正NCF1 delGT致病变异；

• 经白消安预处理后静脉回输。

关键临床结果：

• 集落形成细胞中，携带至少一个矫正等位基因的比例分别为68%（受试者1）和91%（受试者2）；

• 回输产品中GTGT reads比例分别为13%和23%；

• 回输后第30天，二氢罗丹明阳性中性粒细胞比例分别达69%和83%，NADPH氧化酶活性持续维持至随访6个月和4个月；

• 无与PM359相关的严重不良事件；

• 预临床安全性分析：非预期编辑比例<2%，无基因组序列缺失或染色体异常，无可检测脱靶编辑。

PE的安全性考量

1、脱靶活性：

PE的脱靶率通常低于sgRNA引导的核酸酶，但需使用PE专属检测方法（PE-tag、TAPE-seq、PEG-seq）进行评估，传统DSB检测方法（GUIDE-seq、CIRCLE-seq）不适用。

2、靶位点产物纯度：

PE仍可能产生局部indel、部分模板整合等副产物，需严密监测等位基因分布。

3、基因组完整性：

虽然PE不引入预期DSB，但在初级细胞、重复序列丰富区域或高表达递送条件下，仍需评估结构变异可能性。

4、免疫原性：

编辑蛋白和递送载体的免疫原性可能影响重复给药，需通过蛋白工程降低免疫表位。

参考文献：

1. Tao YA, Sakai HA, Jiang AY, et al. AI-guided redesign of laboratory-evolved reverse transcriptases enhances prime editing. Nat Biotechnol. Published online May 21, 2026. 

2. Gori JL, Haddad E, Frangoul H, et al. Prime Editing for p47phox-Deficient Chronic Granulomatous Disease. N Engl J Med. 2026;394(12):1195-1203.