DNA甲基化
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ATAC-seq整体服务
发布时间:2018-07-26 18:47:21 | 浏览次数:

       如果将一个人类细胞的染色体DNA拉成直线,那么长度将超过6英尺;如何将这些DNA装进只有5uM大小的细胞核中,是细胞面临的一个巨大的拓扑学挑战。所以,真核细胞DNA经过折叠组装成为核小体,再进一步包装成染色质;而每个细胞中的这60亿碱基,只有小部分是转录元件可接近的(accessible,即染色质是开放的),具有生物学活性,能与转录元件结合开始合成RNA,其他DNA都被螺旋折叠,藏在凝聚的染色质中。因为染色质结构的这些变化需要许多专门的复合物进行协调,这些物理上的可接近性编码了生物学状态的长久物理记忆,决定了细胞的调控图谱。


为什么要研究开放的染色质?

    染色质开放性是指真核生物染色质DNA和转录因子等蛋白能否结合的开放程度,这一特性反映了染色质转录活跃程度,结合其他DNA修饰(如甲基化)信息,特定条件下的染色质开放性变化可以提供大量的基因表达调控信息,为各种蛋白结合新位点的发现指明方向。还可分析初生组织和细胞(如胰岛β细胞)、临床患者样本,基于染色质开放性特征对患者和样品进行分类。


ATAC-seq:高效、高敏感度、完整的调控组学分析

    ATAC-seq (Assay of Transposase Accessible Chromatin with High-throughput sequencing),即染色质开放性检测,利用转座酶研究染色质可进入性的高通量测序技术。2013年,美国斯坦福大学William Greenleaf教授报道了其研发的ATAC-seq,利用DNA转座酶取代传统研究开放染色质区域使用的DNA酶,准确率与传统方法一致,且重复性更高,只需少量细胞/组织,就能完成高质量的测序,是目前研究染色质开放性的最优策略。

 

技术原理



图1.  ATAC-seq技术原理

A, ATAC-seq文库构建示意图。转座子只能插入开放的染色质DNA,所以利用Tn5转座酶,将携带测序标签的转座复合物加入到细胞核中,后续利用标签进行PCR扩增,即可识别开放染色质; B, 转座后成为DNA片段。在72°C延长,与adapter连接,在扩增,随后PCR扩增出来的序列就包含了adapter、共有序列末端、测序标签。

 

技术应用

    对于未知表观遗传是否在细胞系统的应答发挥作用的情况,或者不清楚哪种组蛋白修饰、转录因子是最重要的,或者细胞数量很少的情况前提下,ATAC-seq是比ChIP-seq更适合的一种研究技术。

1. 初步判断所研究的课题是否涉及表观遗传调控机制;

2. 结合基序分析,识别参与基因调控的转录因子;

3. 识别转录因子调控的靶基因和功能原件;

4.  超级增强子鉴定联合分析,明确活性超级增强子的范围;

5.  通过开放的染色质图谱,可以更好地了解药物或疾病的基因调控和细胞应答机制;识别驱动细胞命运、疾病或应答相关的转录因子。

 

技术优势

1. 灵敏性高,低细胞起始量,每个样本50000个细胞即可;

2. 实验步骤简化,实验重复性好,成功率高;

3. 能同时揭示开放染色质的基因组位置,DNA结合蛋白,转录结合位点的相互作用。

 

送样要求

样本类型:1. 活细胞样本,50000细胞每样本;

         2. 组织样本,质量≥100mg。

样本物种:仅限人、大小鼠,其他物种需评估。

 

样品分组

1. 常规要求至少2组样品,包括对照组和实验组(临床样本为正常人组和患者组)。

2. 样本数建议:3 VS 3。

 

测序方案

1. 测序平台:Illumina HiSeq X10/ Nova

2. 测序模式:PE 150

3. 测序数据量: 15G

 

分析内容

1. 基因组比对分析

2. 基因组富集分析

2.1   富集区域基本信息

2.2   富集区域分布特征

2.3   Peak相关基因GO分析

2.4   Peak相关基因KEGG分析

3.  富集区域motif分析

 

 

案例1:Semenkovich NP. PNAS 2016. 肠上皮内淋巴细胞的微生物对增强子开放性的影响.

 

人类肠道微生物群落和宿主的相互作用,影响着生物功能、代谢以及免疫功能。有假说认为肠道微生物诱导宿主细胞发生表观遗传学变化,改变染色质开放性,让基因表达失衡,于是这项研究对小鼠肠道αβ+和γ δ+ 上皮内淋巴细胞进行了ATAC-seq染色质开放性检测,通过鉴定毗邻普通增强子和超级增强子的基因,揭示了被微生物印象的信号通路网络、代谢通路和增强子相关转录因子。这项研究的结果证明研究遗传修饰,有助于研究宿主免疫细胞系中的微生物群落相关的功能特征。

图2. ATAC-seq信号样本间差异热图

热图显示来自JAK-STAT元件和白细胞跨膜迁移信号传导通路的ATAC-seq信号差异,CONV-R TCR αβ+ IELs开放性增加与增强子相关。

图3. ATAC-seq信号可预测普通增强子和超级增强子

指数曲线显示,最强的ATAC-seq信号发生在少数增强子上。虽然超级增强子只由<5%的IEL增强子组成,但ATAC-seq信号比普通增强子多。这个情况在其他不同组织的研究中也存在,ATAC-seq、靶向p300和Mediator的ChIP-seq有着类似的分布情况。


案例原文:Semenkovich NP, Planer JD, Ahern PP, et al.  Impact of the gut microbiota on enhancer accessibility in gutintraepithelial lymphocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Dec 20;113(51):14805-14810.

 

案例2:Denny SK. Cell 2016. Nfib通过提高染色质开放性促进肿瘤转移

    研究者利用ATAC-seq,比较原发性和肝转移性的小细胞肺癌细胞之间的差异,样本分别来自于4只小鼠重复共计8个样本,发现NFI家族转录因子富集在差异的染色质开放位点中,表明NFI家族转录因子参与调控肿瘤细胞转移。在染色质高开放性位点区域伴随着Nfib拷贝数量增大,且Nfib在侵袭性原发性肿瘤和转移性肿瘤内高表达,Nfib表现出维持染色质及远端调控区域开放和促进神经基因表达的功能,说明了Nfib对促进癌细胞增殖和迁移的重要作用及调控机制。

图4. ATAC-seq检测SCLC细胞的结果

D,8个样本染色质开放性的相关性;E&F,在转移性肿瘤中,约24%的开放区域的开放程度大于2倍。

案例原文:Denny SK, Yang D, Chuang CH, et al. Nfib Promotes Metastasis through a Widespread Increase in Chromatin Accessibility. Cell. 2016 Jul 14;166(2):328-342.


 
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