rG4-seq上线，捕获RNA G-四链体折叠图谱
rG4-seq
RNA G-四链体测序
rG4-seq测序技术通过比较Li⁺与K⁺条件下逆转录酶停滞（RT Stalling,RTS）信号差异，在转录组水平实现RNA G-四链体（RNA G-Quadruplex，rG4）结构的精准鉴定与定位。rG4是RNA分子中重要的高级结构元件，在RNA稳定性、可变剪接、翻译调控及疾病发生等过程中发挥不可或缺的调控作用。
什么是rG4？
rG4是一类由富含G（鸟嘌呤）的RNA序列折叠形成的四链高级结构，其核心由多个G-四聚体（G-quartet）通过Hoogsteen氢键互相连接后堆叠而成，并在中心金属阳离子（特别是K⁺）存在下形成一个坚固的四股螺旋构型。近年来研究发现，rG4广泛存在于mRNA、lncRNA及其他非编码RNA中，可通过调控RNA的转录后加工、可变剪接、亚细胞定位、翻译效率和稳定性等过程影响基因表达。rG4异常形成或调控失衡与肿瘤、神经退行性疾病、病毒感染等多种疾病密切相关，因此已成为RNA结构生物学和RNA药物研发领域的重要研究热点之一。
rG4已知的关键功能作用
翻译调控是rG4最核心的功能，位于5' UTR的rG4通过阻碍核糖体扫描抑制翻译起始，而位于ORF内的rG4可导致核糖体停滞，从而抑制翻译延伸；部分rG4也可作为内部核糖体进入位点（IRES）的组成元件促进翻译【2-4】。
在前体mRNA加工方面，rG4参与可变剪接位点的选择（如BCL-x、FMRP相关转录本），并通过影响3' UTR中的poly(A)信号位点选择调控选择性多聚腺苷酸化，进而产生不同长度的转录本【2，5，6】。
在mRNA稳定性与定位方面，细胞应激（氧化应激、饥饿）可诱导3' UTR rG4广泛折叠，显著增强mRNA稳定性，且该过程在应激解除后可逆；rG4也可作为神经元mRNA树突靶向运输的定位信号【7，8】。
在miRNA调控方面，3' UTR rG4可干扰miRNA与靶位点的结合，而pri-miRNA及pre-miRNA中的rG4结构影响Drosha和Dicer的加工效率，从而调控miRNA的生物发生【5，9】。在端粒维持与端粒酶调控方面，端粒重复序列RNA（TERRA）中的rG4与TRF2的GAR结构域相互作用以维持端粒稳定性，而端粒酶RNA组分（TERC）中的rG4可干扰P1螺旋的形成，进而调控端粒酶活性【5，10】。
在相分离与无膜细胞器方面，rG4通过与含RGG结构域的RNA结合蛋白协同作用，促进液-液相分离，参与应激颗粒、P-bodies及旁斑（paraspeckles）等无膜细胞器的形成与调控【3，5】。
此外，rG4还参与线粒体基因表达调控（GRSF1解折叠线粒体RNA中的rG4以促进线粒体mRNA表达），以及病毒免疫逃逸（EBNA1、LANA等病毒mRNA中的rG4抑制病毒蛋白翻译并调控抗原呈递）【3】。尤其是，rG4的折叠状态受RNA解旋酶（如DHX36）及m6A等RNA修饰的动态调控，其功能的失调与神经退行性疾病、肿瘤等多种人类疾病密切相关【2-4】。
Li+和K+各2个重复，一个样4个文库，需要另外设置生物重复
技术流程
rG4-seq的优化升级
当逆转录酶沿着RNA模板合成cDNA时，如果遇到已形成的rG4结构，会因其空间位阻而发生特异性停滞。这种停滞会导致cDNA合成提前终止，其断点恰好位于rG4结构的3'端。rG4-seq通过三种不同的条件来区分由rG4引起的RTS与背景噪音，包括Li+（背景对照，解链rG4）、K⁺（生理条件，稳定rG4）、K⁺ + PDS（配体条件，强效稳定rG4）。
在rG4稳定条件（K⁺或K⁺+PDS）下，由于逆转录在rG4处停滞，测序reads在rG4位置的覆盖度会出现明显下降；而在对照条件（Li⁺）下则无此现象。通过计算并比较K⁺或K⁺+PDS组相较于Li+对照组的覆盖度骤降（即停滞）情况，利用线性模型拟合和统计学检验（FDR ≤ 0.1），筛选出高置信度的RTS位点，从而在全转录组水平确定经典的和非经典的rG4结构【11】。有研究团队针对rG4-seq的技术流程和分析方法进行了优化，开发了rG4-seeker【12】，能有效消除背景噪音，过滤假阳性信号，不再需要大量重复。
原方案是三种条件（L⁺、K⁺、K++PDS）各4个重复（4×3），共12个文库。而rG4-seeker开发了不依赖重复的分析工作流，结果表明两个重复的rG4-seq实验足以消除噪音，并且K⁺+PDS条件并非必需，意味着可缩减为仅2个条件（L⁺和K⁺）和2个重复（2×2）。在保证高置信度的同时，降低检测成本和确保准确性。
送样要求
仅限人、大小鼠，其他物种需评估
≥1×10^7个细胞，加TRIzol裂解液，干冰寄送
活细胞样本
≥200 mg，加 TRIzol裂解液，干冰寄送
组织样本
总量≥50 μg；RIN≥6，确保RNA无降解
Total RNA
数据分析
分析内容
1. 数据质控
2. 比对基因组
3. rG4-四链体检测
4. rG4结构类型注释
5. rG4基因组区域分布
6. rG4位点top基因排布
7. rG4位点差异分析
8. 差异rG4位点富集分析
rG4位点Li+和K+条件分布
rG4位点展示
rG4位点正负链分布
rG4位点注释
rG4位点基因组分布
rG4-seq研究案例
1、rG4-seeker enables high-confidence identification of novel and non-canonical rG4 motifs from rG4-seq experiments【12】
作者开发了rG4-seeker，并集成于rG4-seq数据集进行分析，从转录组层面共识鉴定出5528个高置信度RTS位点，假阳性（Others类）仅14个，相比原方法在降低假阳性的同时显著提升了非经典rG4（Bulges、2-quartet等）的检出数量。
在新型结构发现方面，额外鉴定出380个新型潜在rG4和47个潜在RNA G-三联体（rG3），并通过PAGE-based RTS体外实验逐一验证，所有6个候选位点均得到证实。分析结果还揭示了一条此前未知的规律：rG4对结构缺陷的容忍度呈5′→3′递减趋势，即5′端的G-tract可更短、连接环可更长，而3′端则相反。
另外，作者利用rG4-seeker的重复独立特性系统评估了重复数量与检测重现性的关系，发现两重复实验可重现约70%的RTS位点，建议将实验规模从12个文库精简至4–6个文库，显著降低实验成本。
2、Differential Evolution of CDS and UTR Non-canonical RNA G-quadruplex Structures in Eukaryotic Transcriptomes【13】
该研究利用rG4-seq技术对7个真核模式生物的转录组进行了全面的rG4结构图谱绘制。通过在Li⁺、K⁺及K⁺/PDS三种缓冲条件下捕获RTS，作者系统鉴定了各物种中的rG4结构，发现非经典rG4（尤其是G2 motif）在所有物种中均占主导地位，且rG4组的规模随进化复杂度整体扩张。
在CDS rG4的分析中，作者发现大多数CDS rG4与重复元件或低复杂度区域无关，其G-tract组成与密码子偏好密切相关——原始真核生物以G为主，而高等真核生物中谷氨酸（Glu）和缬氨酸（Val）的使用显著增加，揭示了CDS rG4随氨基酸偏好演变而逐步积累的进化模式。
在基因家族层面，作者发现古老基因家族（Eukaryota、Bilateria、Vertebrata 进化支）及脊椎动物全基因组加倍保留的ohnolog基因更倾向于携带rG4，支持了"rG4 在基因诞生后才被插入转录组"的假说。
3、G-quadruplex folding in Xist RNA antagonizes PRC2 activity for stepwise regulation of X chromosome inactivation【14】
该文章同样使用rG4测序技术系统绘制了小鼠ESC分化过程中rG4的体内折叠图谱。结果发现，转录组中虽有近90万个潜在rG4基序，但体内真正稳定折叠的仅有54个，且这些折叠位点在分化不同阶段（Day 0/3/7）呈现高度动态变化、时间特异性强。在Xist RNA上，作者鉴定出AF、E7和3'三个rG4簇，其中3' rG4在分化期（Day 7）折叠最为稳定。生化实验证明，折叠的rG4能以高亲和力结合PRC2（Kd低至46 nM），并强效抑制其组蛋白甲基转移酶活性（IC₅₀约57–69 nM）。进一步通过CRISPR敲除3' rG4后，PRC2失去"刹车"而过度激活，导致Xi染色体上H3K27me3大量超富集，但Xist-PRC2复合体同时被困于S1区室、无法向S2转移，最终造成基因沉默失败。使用rG4稳定剂处理细胞得到完全相反的表型，进一步验证了上述结论。据此，作者提出rG4折叠作为"分子变阻器"调控PRC2的"Hit-and-Run"模型，揭示了RNA结构动态调控染色体表观遗传沉默的新机制。
参考文献
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