E5hmC-seq | 低至1 ng，单碱基5hmC羟甲基化测序
项目简介
DNA甲基化是表观遗传调控的重要组成部分。除了研究最为广泛的5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC），由5mC进一步氧化形成的5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）近年来受到越来越多关注。
5hmC不仅参与DNA主动去甲基化，还具有独立的基因调控作用，其分布具有明显的组织、细胞类型和疾病状态特异性。尤其是在肿瘤、液体活检、神经科学、发育与细胞分化等研究中，作为解析疾病相关表观遗传变化和发现新型生物标志物的重要维度之一。
传统Bisulfite测序无法区分5mC与5hmC，大量既往“DNA甲基化”数据实际反映的是两种修饰的混合信号。E5hmC-seq（Enzymatic 5hmC-seq）通过酶法保护与脱氨转换，实现对5hmC的特异性、低损伤、单碱基分辨率检测，为5hmC精准研究提供了新的技术选择。
最初，5hmC常被视为DNA主动去甲基化过程中的一个中间产物。 但越来越多研究发现，5hmC并非单纯“转瞬即逝”的中间状态。它在部分组织和基因组区域可以稳定存在，并具有区别于5mC的分布规律和调控功能，因此目前通常同时将其视为一种具有独立生物学意义的表观遗传修饰标记【2】。
技术原理
什么是5hmC？
5hmC是在胞嘧啶第5位甲基的基础上进一步发生羟基化形成的一种DNA修饰。其主要来源是TET家族双加氧酶TET1、TET2和TET3对5mC的氧化。
在经典的TET介导DNA去甲基化过程中：
C → 5mC → 5hmC → 5fC → 5caC → C
5hmC为什么值得关注？
主流5hmC测序技术对比
E5hmC-seq
E5hmC-seq是基于酶促保护与脱氨转换的5hmC特异性测序技术。首先通过T4-BGT选择性葡糖基化5hmC，使其免受后续APOBEC脱氨；未修饰C和5mC则在APOBEC作用下发生转换。通过测序最终即可将原始5hmC与C、5mC区分，实现单碱基水平5hmC检测。
E5hmC-seq的核心优势
5hmC研究案例
1. Nat Metab：5hmC重塑介导α-KG驱动的肠干细胞命运与生态位更新【3】
老龄线粒体提高α-KG水平，增强TET活性与DNA羟甲基化；5hmC测序进一步显示，α-KG处理后多数DhMR变化与TET驱动的5hmC增加一致，并关联Paneth细胞分化与肠道干细胞生态位更新。
2. Gut：cfDNA 5hmC图谱助力肝细胞癌早期无创检测【4】
这篇论文利用 5hmC测序技术对血浆cfDNA进行全基因组5hmC分析，在2554名受试者中筛选并验证5hmC标志物，最终建立了一个32基因5hmC诊断模型，可用于区分早期HCC与非HCC人群，并优于AFP，尤其对CHB/肝硬化高风险人群中的早期HCC识别有较好表现。
3. Advanced Science：5hmC丢失揭示阿尔茨海默病独立表观遗传异常【5】
在AD模型小鼠海马中，5hmC水平显著下降，而5mC整体基本不变；进一步的单碱基分辨率分析表明，5hmC变化与5mC变化大多彼此独立，且5hmC降低主要涉及神经发生、轴突发育等相关功能区域，支持5hmC作为AD病理中的独立表观遗传标记。
4. Cell Report：TET2介导的5hmC重塑促进急性髓系白血病分化与治疗增敏【6】
ATRA通过RARA上调TET2表达，抗坏血酸进一步增强TET2酶活，两者协同提高AML细胞中的5hmC水平，并在髓系分化相关增强子和转录因子结合位点形成特异性5hmC重塑，伴随染色质开放和转录重编程，最终促进AML及白血病干细胞分化、抑制自我更新，并增强对PARP抑制剂的敏感性。
送样要求
样本量：≥1 ng
样本类型：组织、细胞、血浆、cfDNA
物种：仅限人、大小鼠，其他物种请咨询评估
参考文献
1. López V, Fernández AF, Fraga MF. The role of 5-hydroxymethylcytosine in development, aging and age-related diseases. Ageing Res Rev. 2017;37:28-38.
2. Kharat SS, Sharan SK. 5-Hydroxymethylcytosine: a key epigenetic mark in cancer and chemotherapy response. Epigenetics Chromatin. 2025;18(1):73. Published 2025 Nov 17.
3. Andersson S, Bui H, Viitanen A, et al. Old mitochondria regulate niche renewal via α-ketoglutarate metabolism in stem cells. Nat Metab. 2025;7(7):1344-1357.
4. Cai J, Chen L, Zhang Z, et al. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosines in circulating cell-free DNA as a non-invasive approach for early detection of hepatocellular carcinoma. Gut. 2019;68(12):2195-220
5. Wang ZX, Chen F, He BD, et al. Direct Sequencing of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine at Single-Base Resolution Unravels Their Distinct Roles in Alzheimer's Disease. Adv Sci (Weinh). 2025;12(38):e07843.
6. Leesang TE, Brabson JP, Yap YS, et al. Retinoic acid and ascorbate synergize to suppress myeloid leukemia via TET2 activation. Cell Rep. 2025;44(10):116379.